生物醫學交叉研究院張二荃實驗室證明調控晝夜節律的核心組分RUVBL2是真核生物鐘的共同起源分子
清華新聞網3月27日電 晝夜節律廣泛存在于地球上的生物體中，是生物體預知并響應環境的晝夜變化的重要機制。晝夜節律在維持生理穩態和人體健康中發揮著關鍵作用，其紊亂可能引發睡眠障礙、肥胖、免疫力下降等疾病，并增加癌癥及精神疾病的風險，對人類健康構成嚴重威脅。
生物鐘是晝夜節律的分子機制，以轉錄-翻譯負反饋環路（transcription–translation feedback loop,TTFL）的形式發揮功能。TTFL模型是20世紀90年代提出的，目前在不同生物鐘系統中得到了廣泛應用。然而，隨著研究的深入，TTFL理論面臨諸多挑戰。
3月26日，清華大學生物醫學交叉研究院張二荃實驗室在《自然》（Nature）發表題為“p環NTPase RUVBL2是真核生物中保守的時鐘成分”（The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes）的研究論文。在已有研究基礎上，進一步揭示了RUVBL2作為真核生物鐘的共同核心成分，并支持了最初在藍藻中發現的“緩慢ATP酶活性是生物鐘共同特征”的觀點。
在此前的研究中，張二荃實驗室發現RUVBL2——一種低水解活性的AAA+ ATPase，在哺乳動物的生物鐘復合物（mega-dalton super-complex）中發揮關鍵作用，并調控晝夜節律的相位與振幅。然而，由于周期通常被認為是衡量晝夜節律功能更可靠的參數，而此前的研究缺乏直接證據表明RUVBL2參與周期調控，因此RUVBL2是否為核心生物鐘組分仍存在爭議。為了彌補這一缺陷，該研究團隊利用CRISPR/Cas9介導的高通量篩選技術，對近1000個RUVBL2敲入突變體進行全面分析。實驗結果表明，在人類U2OS細胞中，多個RUVBL2突變體呈現短周期、長周期或無節律的不同表型。這種通過靶向單一基因即可同時調控振幅、相位，并引起雙向周期變化的現象，僅在少數核心生物鐘基因（例如果蠅的Per和藍細菌的kaiC）中被觀察到。此外，RUVBL2的表達具有節律性、可被環境因子調節，并且其敲除會導致無節律表型，進一步證明了RUVBL2是生物鐘的核心成分（圖1）。
圖1.RUVBL2是生物鐘的核心組成成分
（a）在細胞中敲入突變會導致長周期、短周期或無節律的表型，而在小鼠SCN過表達RUVBL2突變體可重現長周期和短周期的節律變化。此外，細胞與小鼠的周期表型呈線性相關；（b）在小鼠SCN中敲除Ruvbl2會導致其在恒定黑暗條件下喪失活動節律
為了探究RUVBL2如何影響生物鐘周期，研究團隊對突變位點進行了深入分析，發現這些突變主要集中在P-loop結構域——這一區域與ATP結合密切相關，提示RUVBL2可能通過ATP水解調控周期振蕩。進一步實驗顯示，RUVBL2突變體的周期調節獨立于TTFL復合物中的CRY，即便在CRY蛋白水平下降的情況下，周期表型仍然存在。這一發現表明RUVBL2可能通過不同于傳統TTFL途徑的方式影響生物鐘周期。
更重要的是，研究人員測定了RUVBL2及其突變體的ATP水解酶活性，結果顯示RUVBL2水解ATP的速度極慢，每24小時僅水解13個ATP分子。這一活性水平遠低于典型AAA+ ATP酶，但與藍藻KaiC的ATP水解速率（每天15個ATP分子）相當。這種低活性可能是維持24小時周期震蕩的基礎。進一步分析發現，RUVBL2的ATP酶活性與細胞周期長度呈顯著負相關——較高的ATP酶活性對應更短的周期，較低的活性對應更長的周期，正如藍藻的KaiC一樣。結合結構分析和定點突變，研究人員發現，與KaiC類似，RUVBL1/RUVBL2晶體結構口袋里的水分子處于不利于對ATP進行親核攻擊的位置，導致RUVBL1/RUVBL2的ATP酶活性極低。這一發現進一步凸顯了RUVBL2與藍藻KaiC在生物鐘調節機制上的相似性，為揭示真核生物與原核生物生物鐘系統的進化關聯提供了有力證據（圖2）。
圖2.在人源RUVBL1/RUVBL2復合物的ATP結合口袋中，水分子的位置與藍藻KaiC相似，都處在一種非優化的進攻ATPγ-磷酸基團的狀態，因而決定了它們是一類極慢速的ATP水解酶
RUVBL在真核生物中高度保守，其氨基酸序列相似性高達85%。通過梳理已有文獻，研究人員發現RUVBL蛋白廣泛分布于多種生物鐘超復合物中，表明其可能與不同物種的核心生物鐘成分存在潛在的相互作用。進一步結合免疫共沉淀和質譜分析，研究人員證實了RUVBL2的同源蛋白能夠與哺乳動物、果蠅、擬南芥乃至粗糙脈胞菌的核心生物鐘蛋白相互作用。此外，利用遺傳學操作和藥理學實驗，研究人員發現RUVBL2在果蠅、擬南芥和粗糙脈胞菌中的同源蛋白也參與晝夜節律調控，并且其ATP酶活性與周期長度的關系與哺乳動物和藍藻一致。這些證據進一步證實，RUVBL2作為保守的低活性ATP酶，在調節真核生物鐘周期方面發揮了關鍵作用。
基于這些發現，研究團隊提出了一個新的假設：在遠古生命起源階段，隨著原始生物鐘的出現，低活性的P-loop ATP酶成為生物鐘系統的核心組件。藍藻中，KaiC結合KaiA和KaiB組成了一個連接到TTFL的強大振蕩器，而在真核生物中，含有P環的AAA+ ATP酶RUVBL2及其同源蛋白通過與TTFL生物鐘蛋白相互作用，參與生物鐘的調控。KaiC和RUVBL2極低的ATP酶活性共同決定了生物鐘的24小時節律振蕩，這一機制或許是生物鐘系統進化的共同特征。
圖3.藝術化呈現的生物鐘起源模型
這個ATP酶驅動的沙漏隱喻了極慢的水解酶動力學決定了振蕩的速度，促成了24小時的晝夜節律。背景中組成六聚體的RUVBL2是真菌、果蠅、植物和小鼠生物鐘系統中的共同起源分子。
綜上所述，該研究在之前的工作基礎上，進一步證實了RUVBL2作為核心生物鐘組分的作用，還揭示了其ATP酶活性如何以類似KaiC的機制調節真核生物的晝夜節律。這一發現豐富了真核生物鐘的分子調節機制，并提出了低活性的ATP酶作為生物鐘起源核心組分的進化假設，在進化生物學和生物鐘研究領域具有重要意義。
清華大學生物醫學交叉研究院研究員張二荃為論文的通訊作者。張二荃實驗室的博士生廖媚妹、劉艷琴和徐占聰為論文的共同第一作者。研究得到中國國家重點研發計劃、科技創新2030-重大項目、北京市政府、清華大學及美國國立衛生研究院的資助。
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